分子系統学実験

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DNA抽出 †

０）処理するサンプルの数だけ2mlのチューブを準備し、番号をキャップとチューブ本体の両方に書いておく。メタルコーンをチューブ１本に１つずつ入れておく。

　サンプルをフリーザーから少量（８サンプルぐらい）ずつ取り出し、氷上におく。サンプルをメスで適当な大きさ(1cm x 1cm）に切る。アロエの場合、内側の液状の部分は取り除く。サンプルを対応する番号のマイクロチューブに入れ、しっかりとふたをする。１チューブあたり100~500 mg が目安の量になる。 　　＊シリカゲルで乾燥した葉の場合、7mm四方ぐらいの大きさの断片１つをチューブに入れる。

１）発泡スチロールの箱（あるいはビーカー）に上記2.0mlチューブを入れ、液体窒素を注ぐ。液体窒素の取り扱いに注意！１度に24本まで処理できるが、８本ずつぐらいがやりやすい。 　　＊シリカゲルサンプルの場合このステップは不要

２）破砕機にチューブをセットし、2500rpmで約8秒粉砕。粉砕し終わったサンプルは次の処理まで氷冷。チューブの移動にはピンセットを使うこと。 　　＊シリカゲルサンプルの場合氷例は不要 　　＊系統研破砕機でメタルコーンを使う場合、2500rpm, 8秒厳守。チューブ破損に注意。

３）チューブを取り出し2 x CTAB溶液（直前にメルカプトエタノールの濃度が0.2%になるように入れておく）800 μlを入れる。 ・このとき、溶液の粘性が高いので、ピペットマンの操作には注意する： ・液体が入った状態で傾けない；　・激しいピペッティング操作をしない;　・サンプルがコンタミしないように気をつける

４）よく撹拌し、60℃〜65℃のインキュベーター（またはヒートブロック）に移し１時間おく。葉の粉がダマにならないよう、ときどき撹拌するとよい。PCRに使うだけなら、ボルテックスでにかけてもよい。 　　　新しい1.5mlチューブを本数分用意し、クロロホルム・イソアミルアルコール混液（クロロホルム：イソアミルアルコール=24:1）を750 μlずつ分注しておく。

５）2.0mlチューブの液体部分を上記1.5mlチューブに移す。強力な磁石でメタルコーンを固定したまま、デカントで液移動。旋回培養器にセットし、10分間攪拌。PCRに使うだけなら、ボルテックスで完全に混ざるまで（エマルジョン）になるまで撹拌。12,000 rpmで10分間遠心。

６）界面のゴミをとらないようにていねいに上清を別のチューブに移す。葉の破片や不純物が混じってた合は、ステップ4) -５）のように、クロロホルム・イソアミルアルコール混液を用いた抽出操作を再度行う。

７）回収された液量をチューブの目盛りで読み取り、2/3 volのイソプロパノールを加えよく混和した後、30分間室温で放置。8,000 rpmで５分間遠心。遠心後ペレットが全く見えないようならば、-20C冷凍庫に入れて1時間から1晩放置。

８）ペレットを捨てないように注意しながら上清をすて、500 μlの70% EtOH（室温）をくわえて沈殿を洗う。

９）8,000 rpmで５分間遠心後、上清をすて、spin down。ピペットマンで残っている70% EtOHをきれいに吸って捨てる。こよりを用いても良い。脱気乾燥5分。

１０）100μlのTEで溶解し、2μlを電気泳動でチェック。

電気泳動 †

アガロースゲル電気泳動（Mupid） †

Mupid（ミニゲル電気泳動槽）用アガロースゲルの準備 †

• 基本

  チェック用ゲル（ウェル幅の狭）   切り出し用ゲル（ウェル幅の広）
  50x TAE                     2.4 ml          3.6 ml
  Agarose S	         　　1.2 g           1.8 g
  蒸留水                    117.6 ml        176.4 ml
  エチブロ溶液(10mg/ml)       6   ul          9   ul
  --------------------------------------------
  Total                     120   ml        180   ml

• 0.5X TAE or 1X TAE ストックを使う場合

  チェック用ゲル（ウェル幅の狭）   切り出し用ゲル（ウェル幅の広）
  Agarose S	         　　1.2 g            1.8 g
  エチブロ溶液(10mg/ml)       6   ul           9   ul
  0.5X TAE                  120   ml         180   ml

• チェックの場合、バンドの有無を確認するためだけなら、0.8-1%のゲル濃度にする。厳密で無くても良い。
• 増幅した断片の長さが短い（500bp未満）が予想されるなら、ゲルの濃度を上げる

ゲル作成の手順 †

1. 120ml作る場合は300mlコルベンにアガロースを計りとり、バッファーを必要量加える。
2. よく攪拌した後、電子レンジに入れて、ゲルを完全に溶解させる。突沸に注意
3. やけどしないように注意しながら取り出し、ある程度冷えたら、エチブロ溶液を必要量加えて攪拌。
4. 60Cぐらいになってから、トレーに注ぐ。あまり熱いときに注ぐと、トレーやコームが曲がる。
5. 気泡を抜いて、コームを差し込み、固める。

アクリルアミドゲル電気泳動 †

TGGE MaxiとAcrylamide - DATDゲルを用いた泳動 †

・ゲル板の準備

0. ゲル板の選択 　サンプルアプライと泳動の方法によって、スペーサー側のゲル板を決める。Perpendicular runの時は、長いサンプルスロット１つがついているもの。Parallel runの場合は小さいスロットが沢山ついている板か、プレーンのゲル板（applicator stripを使ってサンプルアプライ）を使う。

1. Acryl Glideの塗布 　ガラススペーサーのついている方のガラス板に、Acryl Glideを4-5滴垂らす。イエローチップを使って、ガラススペーサーの隅の部分に、Acryl Glideを行き渡らせる。キムワイプを使って、残りの液を全体に広げる。 　スロットフォーマーの上には塗らない。シリコンゴムがあたるところには塗らない。

2. Polybond filmの準備 　スペーサーの無いガラス板に水を数滴たらし、polybond filmをくっつける。ティッシュペーパーで上からこすり、気泡を完全に抜いて接着する。水が多すぎるとゲルが薄くなってしまうので注意。

3. ゲル板の組み立て 　スペーサー側の板にシリコンゴムスペーサーをぴったりのせる。上からpolybond filmをつけたガラス板を（polybond filmが内側になるようにして）載せる。両側を手でしっかり押さえて、上下をひっくり返して置いておく。マニュアルにはステンレスクリップでとめると書かれているが、このまま、ガラスの重さだけでくっつけた方が、ゲル板をばらすときに気泡が入らなくて良い。

・ゲル溶液の準備

　上の方法でゲル板を組み立てる場合、１枚のゲルに60mlのゲル溶液が必要になる。

　ゲル溶液の濃度や組成は、分離する断片の長さ、Tmによって調整が必要。

　MDE Gelを使う場合、0.25xではできあがったゲルがかなり柔らかくなるので注意すること

　Acrylamide-DATDゲルの組成

Conc. (19:1)	50% AA	5% DATD	Formiamide	Urea
4.0%	4.68	2.40	5% 3.0ml	3M 10.81
5.0%	5.85	3.00	10% 6.0ml	4M 14.41
6.0%	7.02	3.60	15% 9.0ml	5M 18.02
7.0%	8.19	4.20	20% 12.0ml	6M 21.62
8.0%	9.36	4.80		7M 25.23

Acrylamide(AA)とDATDはそれぞれの濃度に対応するStock溶液の量が書かれている。FormamideとUreaを使うなら上の分量を加える。

• 700bpの断片を分離するのによく使う条件は、6% Gel (50% AA 7.02ml, 5% DATD 4.1ml) (** DATD conc. increased), 1x TBE (10x TBE 6ml), 7M Urea (25g Urea)でtotal 60ml。TEMED 30ul, 10% APS 300ul で重合させる。200V低電圧で20時間泳動。サンプルは3ul流す。

・ゲル溶液の注入

　100mlのガラスシリンジにゲル溶液を入れ、先端にゲル注入用のチップ（ロングチップの先を切断したもの）をつけ、やや傾けて置いた（手前に細いマーカーペン一本を入れる）ゲル板に、気泡が入らないように注意しながらゆっくりゲル溶液を注ぐ。このとき、水でくっつけているpolybond filmとゲル板の間にゲル溶液が、なるべく入らないようにする。あまり傾けると液漏れするので注意。必要なスロット以外のところに気泡が入っても気にしない。2時間ぐらい放置して固める。

・ゲル板の準備

　ゲルが固まったら、ガラス板をはずす。スペーサー側（上側）のゲル板をゆっくり引き上げる。このとき、ゲル板が下のPolybond filmからはがれないように、また、ゲルとフィルムの間に気泡が入らないように注意する。

　Polybond filmの裏面がゲルの破片やゴミなどで凸凹になっていないか注意。もしゲルの破片が付いていたら、ティッシュペーパーの上にのせて軽く拭く。

・泳動糟の準備

　1. バッファーチャンバーに必要な組成のバッファーを入れる。バッファーは1L準備して500mlずつ入れる。Buffer wickをバッファーに浸しておく。

　2. サーモブロックの上に2mlのthermal coupling solution (0.1% Tween 20)をのせる。

　3. 上で準備したゲル板を、polybond filmごとサーモブロックの上にのせる。サーモブロックとpolybond filmの間には、なるべく気泡が入らないようにする。

　4. サンプルをアプライする

　　サンプルウェルを使う場合には、ゲルを突き破らないようにピペットマンでアプライ

　　applicator stripを使う場合には、ゲルの上にstripをのせ、軽くおさえてゲルに密着させ、サンプルをアプライ

　5. ゲルの上にカバーフィルムを載せ、泳動中の乾燥を防ぐ。aplicator stripを使う場合、カバーフィルムを載せるのはプレランの後。

　6. buffer wickをゲルの両側に平行の載せる。

　7. 必要に応じてプレラン。applicator stripを使う場合には10分ぐらいプレランして、サンプルをゲルの中に入れてから、applicator stripをはずす。それ以外の場合は、7の操作の後にプレランしてよい。

　8. Gel Cover Plateを載せ、本泳動。

注）：通電中は絶対カバーを開けないこと。高温で泳動すると、ゲルの端の方が乾いて、泳動度が変わる。

TGGE: Polyacrylamide-DATD GElからのDNA断片の回収 †

1. バンドを切り出して1.5mlチューブに入れ、NaIO4を200ulずつ入れる

2. 室温でゲルが溶けるまでMIX

3. ゲルが完全に溶けたら、Glassmilkを2ul加えてvortex. 5min放置

4. 12000rpm, 10sec

5. 上澄み捨てて、NEW Washバッファーを500ul加え、vortex. 12000rpm, 10sec.

6. 上澄み捨てて、Flash

7. 残ったバッファーをこよりかピペットマンで完全に取り去る。＜吸引乾燥＞

8. DDW 10ul加えVortex, 5min放置。12000rpm, 2min 遠心。

9. 上澄み1ulをtemplateとしてPCR

参考資料 †

• アマシャムアプリケーションガイド
• 標準技術集

PCR †

25ul基本システム †

Primer Mix (eq. vol. 5pmol/ul) 1 ul　(0.5ul each primer)
PCR Premix                     4.6 ul
Template DNA (ca.100ng/ul)       1 ul
DDW                           18.4 ul

PCR Premixの内容

10X PCR              500 ul
2.5mMdNTP            400 ul
Taq (0.25u/reaction)  25 ul

操作 †

1. Premixを溶かしておく. On Ice.

2. 8連チューブを準備。On Ice.

3. Premixをチューブに分注　（液滴をつける場所を４区画に区切る）

4. Primer (mix)をチューブに分注　（Premixにはさわらないように）

5. Template DNAをチューブに分注

6. DDWを加える

7. Spin Down

8. Thermal cyclerにかける

PCR産物の精製 †

参考サイト: 精製の重要性byABI Japan

GeneCleanIIIによるDNA断片の回収 †

１）PCR産物等をMupidで電気泳動する。大きなコームを使って1%ゲルで電気泳動。コームの大きさによっては、ゲルの厚さを調節する。泳動用バッファーは切り出し用の電気泳動の度に交換する。

PCR産物25ulを0.8%ゲルで泳動。マーカーλHindIII(125ng/ul)2ul

２）長波長の紫外線ランプを用いて、目的のバンドを切りだし、エッペンドルフチューブに移す。目的のバンドのみをなるべく小さく切り出した場合、チューブに加えるNaIの量は250μL。大きく切りすぎた場合はチューブごとゲルスライスの重さを量り、３倍量のNaIを加える(200mgのゲルに対して600ulが目安）。55度でゲルが完全に溶けるまで保温する。

長波長の紫外線ランプを用いる理由は、DNAに対するダメージを防ぐため。中波長、短波長の方がバンドは見やすいが、短い時間でDNA分子が寸断される。

３）ゲルが完全に溶けたら2.5μLのグラスミルクを加え、室温で5分おく。

４）14,000g（このラボで用いている遠心機では12,400rpm）で5 秒遠心し、上清を捨てる

５）New Wash Bufferを600μL加え、ボルテックスしてGlass Milkを再懸濁。14,000gで5 秒遠心し、上清を捨てる

Option: ６）５）を繰り返し。

７）壁面のバッファーをスピンダウンして集める。ピペットマンかこよりで残ったバッファーを完全に取り除く。

８）10μL-50μLの滅菌水を入れ、１分間放置。

９）14,000gで2分遠心し、上澄を別のチューブに移す。1-2μLを電気泳動し回収をチェック。大体の収量をマーカーと比較してサイクルシーケンシング反応に用いるかどうかを決定する。

Gen Clean後のチェック泳動像。PCR産物25ulを泳動し、GenCleanで処理した後、10ulのDDWにDNAを溶出させた。そのうち1ulを泳動。マーカーはλHindIII 2ul.

PEG沈 †

非特異産物が無い場合（目的のバンドだけが見えたということ）使える方法。GenCleanがうまくできないとき、試してみると良い

１）50ulのPCR反応液に対して以下の溶液を加える

4M NaCL 8.0ul　　(3.2ul for 20ul PCR sol.)
13%(w/v) PEG 8000  40ul  (16ul for 20ul PCR sol.)

２）氷上 20-30 min

３）遠心　4C 14,000rpm 20min

４）70% エタノール 500ulでリンス（必要に応じて繰り返し）

５）減圧乾燥

６）DDW 5-10ulに溶かす

７）1ul を泳動して濃度チェック

ExoSAP-IT †

サイクルシーケンシング反応 †

０）準備：

・シーケンシングプライマー　0.8pmol/ul

・精製済みテンプレートDNA。使用前に必ず濃度をチェックする。上の写真のように、λHindIII(125ng/ul) 2ulのマーカーと比較して、1ulを流したときのバンドが560bpのバンドよりもやや濃いぐいらい（サンプルの左半分）なら、1ulを反応に使用する。右半分のバンドが薄いものだと、1ulではシグナルが弱くなる。

１）PCRチューブに次のものを加える

1-1) 基本の反応システムの場合（600bpより長い配列向き。Long Gel）

Ready Mix         2ul
Primer (0.8pmol/ul)  1ul
Template          1ul　（濃度が薄い場合は2ul。DDWは入れない）
DDW               1ul
---------------------
total             5ul

1-2) 薄め液を用いる場合　（600bpより短い配列向き。Short Gel）

Ready Mix          1ul
5x dilution buffer 1ul
Primer (0.8pmol/ul)   1ul
Template           1ul （濃度が薄い場合は2ul。DDWを入れない）
DDW                1ul
---------------------
total              5ul

２）サイクルシーケンシング反応は、ABIのデフォルトの反応サイクルを用いる。繰り返しの多い配列ではアニーリング温度を上げるとか、プライマーのマッチングが悪い場合はサイクルの反応時間を変えるなどの工夫が可能。

３）反応後の処理：8連チューブで反応させている場合、全てマルチチャンネルピペットを用いて行うと効率的。

1. DDW 15ul を加える
2. EtOH, 3MNaOAc 混液(50:2) 50ul を加えて混ぜる。室温で10分放置
3. 遠心 14,000rpm 25min
4. チューブを振って上澄みを捨てる
5. 70% EtOH 100ul を加え、軽く攪拌
6. 遠心 14,000rpm 10min
7. <optional> ゲルイメージで、流れ始めにやたら大きいスポットが出る場合、70%リンスを繰り返す
8. チューブを振って上澄みを捨てる
9. スピンダウンして残った70%EtOHを完全に除去（こより等を使う）
10. 乾燥　（自然乾燥か減圧乾燥）
11. ホルムアミドとDyeの混液(5:1)を0.8ul加える。
(大量のサンプルを処理するときには、マルチチャンネルピペットで壁面につけ、
スピンダウン。ボルテックスで十分に攪拌してからスピンダウン再度）
12. 流すときまで-20Cで保存

シーケンサの使用(ABI 377) †

タイムコース †

ゲル作りの作業：　１時間弱

ゲルの重合：　１時間半

泳動準備とサンプルローディング：　30分から１時間

乾燥したサンプル全量を0.8μlのローディングバッファーに溶かしておく

電気泳動：　Short Run (up to 600bp)：７時間、Long Run (up to 800bp): 10時間

サンプル処理数 †

泳動できるサンプル数は18+α - 36+α

シャークティースコームを選択することで泳動できるサンプル数が増やせるが、その分、サンプルアプライが難しくなる

手順 †

I) gel 溶液の調整 †

１） 室温でスターラーにかけよく溶かす。

２）フィルター濾過して、脱気。

II) ゲル板の組立て †

１）ゲル板をBioNox洗剤（蛍光をふくまない）と専用スポンジで丁寧に洗う（スチール面はゲル板に傷がつくので絶対つかわないこと）。ゲルを作る面はていねいに洗う。シャークティースコーム、スペーサーも洗っておく。

２）洗剤をよくすすぎ、蒸留水でよくリンスする。

３）発泡スチロールの台のに載せ、ケイドライをつかって水分をふき取る。エタノールを吹き付けて拭いてもよい。最後に2-プロパノールを用いて、ゲル板の内側を特に念入りに拭く。読み取り部位は特にきれいにする。

４）プレーンのガラス板をグレーゲルカセットにセットし、その上に乾いたスペーサーを置く。

５）上からノッチのガラス板を重ね、スペーサーの位置を調整しながらセットし、中の方のクランプを止める。ゲル板の下端とスペーサーの下端がピッタリあっていることを確認すること。

６）クリアブレースをセットし、クランプを止める。このとき一番下のゲルインジェクターをとめるクランプは止めないでおく。

８）ゲルインジェクターをセットする。ツメの部分がカセットの穴にきっちりはまるよう、押さえつけてはめる。クリアブレースが取り付けていないと、ゲル板がずれることがあるので注意。

９）ゲルイジェクターに注射器をとりつける。口が片方に偏った注射器の場合、口が上方にくるようにとりつけると泡がはいりにくい。

１０） ゲル溶液に10%過硫酸アンモニウム(APS)とTEMEDを以下の分量で順に手早く加えて良く撹拌する。注射器にゲルを流し込み、泡がはいらないようにガラス板を軽くたたく。

１１）上端までゲル溶液が届いたら、泡がはいらないようにシャークコームの反対側（平らな方）を差し込む。

１２）クランプでクリアブレースを止める。

１３）インジェクターをはずす。一番下のクランプは留めないでおく（ガラスとゲルの間に気泡が入るのを防ぐ）。

１４）ゲルが固まるらないように、インジェクター等の器具をすぐに洗浄する。

１５）1時間半程度でゲルが固まる。あまり長くおいておくと耳の部分のゲルが縮んでバッファー漏れを起こすことがある。

III) ゲル板のシーケンサへの取り付け †

１）ゲルが固まったらコーム部分にD.W.をかけ、コームをゆっくり抜き取る。コームは洗っておく。ゲルカセットからゲル板をはずし水洗い。コームが入る部分に強い水流はあてない。

２）スキャン部位は特に丁寧にあらい、D.W.ですすぐ。

３）ゲル板を発泡スチロール板の上に置き、ケイドライでよく水分をふきとる。水分がとれたら磯プロパノールをたらし、ケイドライでガラス板をよく拭く。コーム部位にゲルの破片が挟まっていたら、除去する。

４）ゲルカセットについたゲル溶液などは、D.W.ですすぎ、ティッシュで拭き取る。ゲルカセットにゲル板をセットし、ゲルカセットのビームストップを倒しクランプでとめる。。

５）シャークコームをゲルの上部に0.2mm程度差し込む。

６）ABI377 シーケンサの電源を入れ、コンピューターをたちあげる。

７）シーケンサにローワーチャンバーをセットし、電源コードを差し込む。ゲル板をシーケンサの側のクランプにあわせ、対角線の順でクランプを止める。

８）ドアを閉め、シーケンサ本体の背面からカチッという音がするのを待つ。この音は本体とコンピュータの連絡がとれたことを示す。30秒してもならない場合は、次の操作に進む。今後ドアの開け閉め操作のときには、いつもこの音に注意する。連絡がとれる前にコンピュータ側の操作を行うと、データの転送に不都合が生じる場合がある。

９）ABI Prism ソフトウェアをたちあげ、ファイルメニューからNewを選択し、Sequence Runアイコンをクリック。Plate Checkボタンをクリック。

１0）Scan画面でノイズが無いことを確認。もし汚れがみられれば（波形に突出したピークがでる）、ゲル板を取り外し、スキャン部位をきれいにする。拭いてもピークが泣くなら無い場合でも、PreRunをするとピークが消える場合がある。

１１）アッパーチャンバををゲル板上部にひっかけ、両側のクランプを上から下に回して止める。電源コードを差し込む。

１２）10x TBEバッファーを希釈して1xTBEバッファーを1.35リットル作っておく。

１３）アッパーチャンバに1X TBEバッファーを入れる。Warningの線をほんの少し過ぎるぐらい。バッファーが漏れがないかを確認し、ローワーチャンバにもバッファーを注ぐ。液ゲル板の下端がバッファーに浸かっていることを確認。

１４）注射器にバッファーを吸い、ウエルをリンス。水流が強すぎるとゲルの上面がゆがむ。ドアを閉じ、連絡音を（あるいは30秒ぐらい）待つ。

１５）PreRunボタンをクリック。1分程度PreRunを行ったら、Pauseしておく。キャンセルすると次の動作でビーム位置が合いにくい場合があるので、必ずPauseする。

１６）冬場に室温が低く、循環水の温度が低いと（20C以下）ここまでの操作の途中に、"Thermister open/short circuit"のエラーが出ることがある。PreRunをとりあえず行い、タンク内の水を温めればエラーは解消する。

シーケンスデータの解析 †

FASTA形式ファイルの作成 †

• Sequencing Analysis, Sequence Assemler, Sequence Navigator等で編集後、配列データをテキストファイルで保存。
  • ファイル名は解析時に用いるサンプル名にしておくと便利（サンプル番号等でも良いが、サンプル名との対応がとれるようにしておく）
• Genetyx Macを起動
  • File > Multi Sequence
  • (Remove Allをクリック) > Addでシーケンスの入ったテキストファイルを追加
• Parallel Sequence Editor画面で、右端のアイコン「＞」をクリックすると、FASTA形式ファイルができる
  • （テキストファイルの扱いに慣れている人は、テキストエディタやシェルスクリプトからFASTA形式ファイルを作っても良い。なるべくコピーペースは避ける方が間違いが少ない）
  • FASTA形式ファルとして保存

アラインメント †

• Clustal Xを起動
  • Load Sequenceで上で保存したFASTA形式ファイルを読み込み
  • Alignment > Do Complete Alignmentでアラインメントを実行
  • File > Save Sequence as を選び、NBRF/PIR形式でアラインメントを保存

アラインメントのマニュアルエディット／閲覧 †

• Se-Alを起動（Windowsの場合はBioEditが良い。Fasta形式ファイルをBioEditで開き、アラインメントもメニューから実行できる）

PAUP*を用いて系統解析 †

• PAUP*を起動
• File > Import Data : 上で作ったPIR形式ファイルを選択。ファイル形式で「NBRF-PIRを選び、Import
• File > Execute （適当なファイル名で保存。拡張子は.nexか.pauにしておくと良い）

  Processing of file "ファイル名" completed.　表示されたらexecute終了

• まず単純に解析するなら、シーケンスデータの曖昧な部位やギャップを削除
  • Data > Include/exclude characters > CharSetでMissAmbigを選択：　曖昧な部分やギャップのサイトが選択されるので、exclude
• Analysis > Parsimoyを確認して、Heuristic Search
• Tree > Print Tree > Preview

参考資料 †